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Introduction

신약개발에서 진행되는 연구 중 MHC(Major Histocompatibility Complex, 주조직 적합성 복합체)와 펩티드(peptide)의 결합 친화도(binding affinity)를 예측하는 연구 분야가 있다. 먼저 MHC 같은 경우는 면역 반응에 관여하는 당단백질로, 대표적으로 백혈구(HLA, Human Leukocyte Antigen)가 있다. 펩티드의 경우 단백질과 동일하게 아미노산으로 구성되지만 단백질을 결정짓는 3차원 얼개가 없는 것이 가장 큰 차이점이다. 그렇다면 MHC-peptide의 binding affinity 예측은 왜 중요할까? 이는 MHC와 펩티드 간 상호작용하는 그 기전에 답이 있다. 결론은 향후 신약을 만들었을 때의 우리 몸의 면역 반응을 판단하기 위함이다.

MHC-peptide 면역학적 상호작용

MHC는 항원으로부터 떨어져 나온 펩티드 조각을 인식하는 능력을 갖고 있다. MHC는 세포표면에 자신이 만든 그루브에 펩티드 조각을 꽂아두면 면역 반응에 관여하는 T 세포가 와서 T 세포 수용체로 면역원(펩티드)을 인식하고, 만약 악성이라 판단될 경우 항체를 만들라는 면역 반응을 일으키게 된다. 하지만 이와 같은 기전이 일어나기 위해서는 MHC와 펩타이드 둘 간의 충분한 binding affinity로 결합이 되어야만 T 세포가 활성화 될 수 있다. 그렇기에 binding affinity를 예측하는 것은 이러한 면역학적인 과정을 이해하는 데 한 걸음 나아가는 것과 같고, 향후 신약 개발에 있어 후보 물질이 될 수 있는 펩티드를 스크리닝하는 데 많은 도움이 된다.

펩티드의 장점과 단점

참고로 펩티드 의약품은 분자 구조상 독성 문제가 적고, 조직 내 축적량이 적어 신약 후보물질로 주목 받는다. 하지만 체내에서 쉽게 분해된다는 단점이 있어 체내 안정성 확보가 어렵고, 이러한 펩티드 후보 물질을 탐색하는 시간이 오래걸린다는 문제가 존재한다. 

MHC-peptide binding affinity 예측 연구의 과거와 현재

연구의 흐름은 in-vitro 방식에서 in-silico 방식으로 바뀌었다. 과거에는 일일이 MHC-peptide의 binding affinity를 계산했다. 하지만 이는 수많은 시간과 자원이 소모되었는데 그 이유는 MHC의 특성상 매우 큰 다형성(polymorphism)을 가졌기 때문이다. 다형성으로 인해 MHC와 펩타이드 시퀀스 간의 여러 경우의 수를 다 고려할 수 없었고, 따라서 computational 접근으로 나아가게 되었다. 이 computational 접근이 in-silico 방식의 또 다른 이름이다. in-silico 방식으로 나아갈 수 있게 된 배경은 in-vitro 방식을 통해 MHC-peptide의 binding affinity에 대한 데이터가 쌓였고, 아래와 같은 데이터셋이 축적되며 가능해졌다.

위와 같은 데이터셋들은 MHC-peptide binding affinity에 관한 아래의 주요 데이터베이스들에 모이게 되었다. 

참고로 현재에도 대표적으로 가장 많이 사용되는 데이터베이스는 IEDB이다. in-silico 방식에는 위의 데이터베이스를 활용하는 크게 두 가지 방법이 있다. 첫 번째는 allele-specific 방법이고, 두 번째는 pan-specific 방법이다. 참고로 allele란 대립유전자를 의미하는 것으로 지금의 문맥에서는 인간의 MHC인 HLA를 의미한다. 아래는 두 방식에 대한 그림이다.

두 방식의 공통점은 머신러닝 모델을 만들어 예측하는 것이다. 핵심 차이점은 allele-specific은 하나의 allele당 하나의 모델을 만들어야 하는 반면 pan-specific 방법은 하나의 모델에 여러 allele를 학습시킬 수 있다. 때문에 allele-specific 방법은 범용성은 약하지만 특정 allele와 peptide가 어떤 binding affinity로 결합할지에 대해 pan-specific에 비해 비교적 더 정확하게 예측할 수 있다는 장점이 있다. 반면 pan-specific 모델은 특정한 allele와 peptide의 binding affinity 예측에는 약하지만, 전반적으로 일반화된 성능을 낼 수 있다는 것이 장점이다. 

하지만 최근에는 증가하는 데이터셋과 머신러닝 모델 구조로 인해 allele-specific 모델보다 pan-specific 방식이 더 많은 각광을 받는 추세이며, 나아가 pan-specific 모델에 transfer learning을 적용함으로써 allele-specific 모델의 장점을 함께 취하는 방식도 사용되고 있다.

MHC-peptide binding affinity 예측 도구

MHC-peptide binding affinity를 예측 하는 도구들은 1990년대 말 이후 지금까지도 관련 연구자들에 의해 만들어지고 있다. 아래는 2011년 기준으로 사용되고 있는 pan-specific 모델을 정리한 표이다. 

참고로 MHC는 크게 3가지 클래스가 존재한다 MHC-I, MHC-II, MHC-III이다. 하지만 연구는 주로 MHC-I과 MHC-II를 기준으로 이루어진다. 위 그림을 크게 MHC-I pan-specific 예측 모델과 MHC-II pan-specific 예측 모델로 나눌 수 있는데, MHC-I에는 버전이 업그레이드되어 지금도 좋은 성능을 보이고 있는 NetMHCPan이 대표적이라 할 수 있다. 현재에는 더 발전하여 이외에도 ACME, DeepSeqPan, DeepAttentionPan, 등의 모델이 있다. MHC-II 같은 경우도 마찬가지로 NetMHCIIpan 모델이 대표적이라 할 수 있고 현재에는 더 발전하여 이외의 모델들이 여럿 존재한다. 

MHC-펩티드 피처화 방안 & 머신러닝 모델 종류

allele-specific 모델과 pan-specific 모델은 학습을 위해 MHC와 펩티드를 피처화 시키는 과정이 중요하다. 머신러닝을 사용하지 않고 계산했던 과거에는 Scoring Matrix를 사용했고 동작은 다음과 같다.

축적된 MHC-peptide에 대한 데이터를 기반으로 BLOSUM62와 PSSM이라는 대표적인 scoring matrix를 사용했다. 이는 펩티드의 motifs를 찾으려는 시도로, motifs는 특징이 보존된 짧은 펩티드 서열을 의미한다. scoring matrix를 만들기 위해 펩티드의 물리 화학적인 특성이나 한 아미노산에서 다음 아미노산으로 어느 정도의 빈도로 바뀌는가 또는 시퀀스의 유사도를 계산한 값을 반영한 matrix라 할 수 있다. 이를 통해 최종적으로 MHC(HLA)와 펩티드 시퀀스가 어느 정도의 binding affinity로 결합할 것인지 예측하는 것이다. 2019년 기준 대표적인 도구 리스트는 다음과 같다.

하지만 이 방법에도 단점이 있었으니, 정적인 scoring matrix를 통해서는 문제를 선형적으로 풀 수 있을 뿐 동적이고 비선형적으로 풀기 어렵다는 것이다. 이러한 한계점으로 인해 머신러닝 기반의 방법이 사용되었다.

기존 scoring function 기반 방법과의 차이점은 뉴럴넷에 학습을 시킨다는 것이다. 하지만 동일한 것은 여전히 피처화 시키는데 있어서 BLOSUM62와 PSSM, one-hot encoding과 같은 방법을 사용한다. 데이터셋으로는 in-vitro 방식 또는 이전 연구들에서 binding affinity가 실험적으로 검증된 것을 사용하며 결과적으로 펩티드를 binder 또는 non-binder로 분류하는 것이 특징이다. 2019년 기준 대표적인 도구리스트는 다음과 같다.

그 중 가장 대표적인 모델은 NetMHCPan4.0이 있고, 후속 연구들에서 비교 대상으로 자주 사용된다.

마지막으로는 consensus 방식으로 scoring function 기반 방법과 machine learning 기반 방법을 결합한 것이다. 

정확히는 scoring function 기반의 모델과 machine learning 기반의 모델의 출력값에 가중치를 부여하여 앙상블하는 방법이다. 예를 들면 가장 믿을 만한 모델의 예측 값에는 N점, 조금 낮은 모델의 예측 값에는 N-1점, ...을 부여하여 가중합을 매기고 평균을 구하는 것이다. 패러다임 시프트가 없는 이상 위와 같은 방법이 계속 사용될 것으로 전망된다. 2019년 기준 대표적인 도구 리스트는 다음과 같다.

가장 최근에 나온 MHCflurry1.2.0이 가장 대표적인 도구일 것이다.

여기까지 신약개발의 연구 분야 중 하나인 MHC-peptide binding affinity prediction의 연구 동향을 살펴보았다. 이 연구 분야에 대해 알아볼 때 생각보다 국내 자료가 많이 없어 빠른 파악이 힘들기도 했기에 관련 연구를 지향하는 사람들에게 작은 도움이 되었으면 한다.

Reference

[1] Toward more accurate pan-specific MHC-peptide binding prediction: a review of current methods and tools

[2] A comprehensive review and performance evaluation of bioinformatics tools for HLA class I peptide-binding prediction

우리 몸을 구성하고 생명활동을 움직이게 하는 단백질은 과연 어떻게 만들어질까? 단백질은 본질적으로 아미노산으로 구성된다. 아미노산이 짧은 수로 모이게 되면 펩타이드(Peptide)라 부르며, 많은 수가 모이면 단백질이라 부른다. 그렇다면 이 아미노산은 어떻게 만들어지게 될까? 생물학에서는 아미노산으로부터 단백질이 만들어지는 과정 전체를 센트럴도그마라고 부른다. 센트럴도그마는 크게 전사(Transcription)와 번역(Translation)의 두 과정으로 이루어진다. 전사와 번역을 알기 위해서는 먼저 DNA와 RNA를 알아야 한다. 먼저 요약하면 DNA는 단백질을 만들기 위한 설계도이며, RNA는 설계도를 기반으로 단백질 제조 역할을 한다. DNA는 개념적으로 디옥시리보핵산(DeoxyriboNucleic Acid)를 의미하는 것으로, 원핵 생물과 진핵 생물의 세포에 공통적으로 존재한다. RNA는 리보핵산(RiboNucleic Acid)를 의미하는 것으로 RNA에서 산소 원자가 하나 빠진 것(De-oxy)이 DNA이다. 

DNA의 구성요소는 크게 4가지로 ATCG(아데닌, 티아민, 사이토신, 구아닌)의 염기로 구성된다. 컴퓨터가 0과 1로 이루어진 2진수 체계이듯, 우리 몸은 ATCG라는 염기로 구성된 4진수 체계라고 할 수 있다. 2진수 체계인 지금의 컴퓨터로 무수한 것을 할 수 있듯, 4진수 체계인 우리 몸은 컴퓨터보다 더 큰 복잡성을 가진다. 이 복잡성은 4가지 염기의 결합에 의해 나타난다. 4가지 염기는 상호 결합이 정해져 있다. 가령 A는 T와 결합하고 C는 G와 결합하는 식이다. 이렇게 AT, TA, CG, GC로 결합한 염기쌍(base pair)들이 이어져 DNA 시퀀스가 된다. (참고로 RNA는 T대신 U(우라실)이 쓰인다.) 앞서 말했듯 DNA에는 어떤 단백질을 생성해야 할지에 대한 설계도를 가지고 있다 했다. 이 설계도는 DNA 시퀀스와 같다. DNA 시퀀스의 3개의 염기를 묶어 하나의 코돈(Codon)을 구성한다. 코돈은 우리 몸에 어떤 아미노산을 만들지 결정한다. 가령 AAA라는 3개의 염기가 모이면 라이신이라는 아미노산을 만들고, GCC라는 3개의 염기가 모이면 알라닌이라는 아미노산이 만들어진다. 인간의 몸에는 크게 20개의 아미노산이 있고 각각의 코돈들은 20개의 아미노산 중에 하나를 만들게 된다. 코돈이 어떤 아미노산으로 만들어질(부호화될)지는 유전 암호(부호)를 통해 확인할 수 있다. 아래는 기초과학연구원에서 가져온 유전 암호 표(?)이다. 

참고로 다른 코돈이라도 같은 아미노산을 만들 수 있는 것이 특징이다. 여기서 중간 정리를 하자면, 전사(Transcription) 과정은 DNA 시퀀스에서 코돈이 될 3개의 염기를 읽어들이는 과정이다. 이 때 RNA가 관여하여 읽어 들이며, RNA가 3개의 염기 정보를 가지고 있으면 이를 mRNA (Messanger RNA)라 부른다. 전사 과정에서 만들어진 이 mRNA의 한 가닥은 인트론(Introns)과 엑손 영역(Exons)으로 나뉜다. 엑손은 단백질이 암호화된 영역이고 인트론은 비암호화된 영역이다. mRNA를 번역(Translation)에 사용하기 위해 비암호화된 영역인 인트론을 제거하고 5'cap과 3' poly-A tail라는 것을 추가한다. 그 다음 인접한 엑손끼리 결합하는데 이러한 과정을 대체 이어 맞추기(alternative splicing)이라고 한다. 이어 맞추기 과정은 큰 의미를 가진다. 그 이유는 mRNA에 담긴 일부 정보인 인트론을 제거한다는 것은 곧 원래의 DNA 서열과 달라질 수 있음을 의미하고 이는 하나의 DNA 서열이 실제로는 여러 단백질을 만들어낼 수 있다는 것을 의미한다. 

다음으로 번역(Translation) 과정은 mRNA가 설계도를 가지고 단백질 제조공장인 리보솜에 가서 단백질을 주문하는 것이다. 제조 과정에는 rRNA와 tRNA가 관여한다. rRNA는 리보솜 RNA를 뜻하며, tRNA는 전달 RNA를 뜻한다. tRNA는 코돈을 인지하고 올바른 아미노산을 추가하는 역할을 하며, rRNA는 아미노산의 펩타이드 결합에 관여한다. 간단하게 기술하였지만 사실 조금 더 복잡한 기전이 이루어진다. 번역 과정에 사용되는 특별한 코돈이 있다. 번역 개시 코돈, 번역 종료 코돈이다. 번역은 mRNA의 개시 코돈에 리보솜 소단위체가 결합하며 시작한다. 이후 mRNA의 코돈 정보는 tRNA의 안티 코돈을 리보솜으로 운반한다. 여기서 안티코돈이란 mRNA의 코돈과 상보적인 결합을 이루는 염기쌍을 의미한다. tRNA의 안티코돈을 통해 아미노산이 리보솜으로 운반된다. 이러한 과정을 반복하여 아미노산들이 차례차례 연결되면서 단백질 합성 과정이 이루어진다. 마지막으로 tRNA가 mRNA의 번역 종료 코돈과 결합하면 아미노산 중합 반응이 끝이 난다. 이후 만들어진 단백질은 세포 내 기관인 소포체안으로 들어가고, 골지체를 통과하며, 분비 소낭을 통해 세포막을 통과한 뒤 필요로 하는 곳에 분비된다. 이렇게 만들어진 단백질은 소화 과정에서 음식을 분해하여 에너지를 얻는 대사과정과 같이 신체 대부분의 생리 기능이 발휘하기 위해 사용된다.

Reference

[1] 유전암호

https://www.ibs.re.kr/cop/bbs/BBSMSTR_000000001003/selectBoardArticle.do?nttId=19630

아미노산

아미노산이란 단백질을 구성하는 요소이다. 아미노산들이 적은 개수로 결합되면 이를 펩타이드(peptide) 또는 펩티드라 부르며 많은 수가 결합되면 이를 단백질이라 부른다. 이러한 아미노산은 DNA에 포함된 유전자를 RNA가 전사하고 번역하는 과정에서 만들어진 코돈에 따라 어떤 아미노산으로 만들어질지(encoding) 결정된다. 아래는 아미노산의 구조를 나타낸다. 

아미노산은 탄소 원자를 중심으로 크게 3부분으로 아미노기(NH2), 카복실기(COOH), 곁사슬로 구성된다. 자연계에는 300 종류의 아미노산이 있지만 포유류에게 미치는 아미노산은 20종류가 된다. 포유류인 인간에게 영향을 미치는 20종류 의 아미노산 중 19가지가 위의 구조를 따른다. 단지 나머지 아미노산인 프롤린(proline)만이 이를 따르지 않는다는 특징을 가진다. 결과적으로 아미노산의 종류를 결정 짓는 것은 곁사슬 R에 어떠한 것이 결합되느냐에 따라 아미노산의 종류가 결정된다. 한 가지 특이한 점은 아미노기와 카복실기는 산과 염기의 세기를 나타내는 pH에 따라 NH3+의 형태나 COO-로 이온화되어 존재할 수도 있다는 특징을 가진다.

펩타이드 결합

펩타이드의 정의를 다시 짚고 넘어가자면 아미노산 중합체로서, 아미노산이 여러 개 합쳐진 것이라 할 수 있다. 

펩타이드의 결합은 한 마디로 탈수축합반응이라 할 수 있다. 그 이유는 위의 그림과 같이 아미노산에 붙은 카복실기(COOH)와 아미노기(NH2)에서 각각 OH와 H가 빠져나오면서 아미노산 간의 결합이 이루어지는데 각각 빠져나온 것을 결합하면 물 분자인 H2O가 되기 때문이다. 

Reference

[1] https://m.blog.naver.com/dyner/100205931883

[2] https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%95%84%EB%AF%B8%EB%85%B8%EC%82%B0

[3] https://m.blog.naver.com/ckjumpup/222068594773